「在妹妹的房间用妹妹的电脑玩对妹妹耍流氓的游戏」这个梗的含义是指爸爸高坂大介在动画《我的妹妹不可能这么可爱》中，发现妹妹桐乃有R-18的东西时进行的一次训斥。他质问京介是否在妹妹的房间用妹妹的电脑玩对妹妹耍流氓的游戏。

这个梗起源于《我的妹妹不可能这么可爱》动画中的一幕，时间为2010年，人物名字为高坂大介，这部动画由AIC Build制作。具体事件是高坂大介发现妹妹桐乃有R-18的东西后对她发火，质问京介是否在妹妹的房间用妹妹的电脑玩对妹妹耍流氓的游戏。这段情节引发了一系列的梗和讨论。

要正确运用这个梗在社交生活中，你可以用这个梗来嘲笑别人调戏妹妹的行为，或者调侃周围人中的犯二的人。举个例子，当你看到别人无理取闹或者过于关心自己妹妹时，你可以用这句台词来嘲笑他们，例如「你又在妹妹的房间耍流氓了吧？」